RNAi FAQs

Q1:设计RNAi实验时，在不同网站进行目标序列的筛选，得到的序列往往不一致，甚至毫不相同。各个网站推荐的目标序列的位点都不相 同，该如何是好？
A1:设计RNAi目的片断只要在全长cDNA里搜索以aa起始的片断，任意一段21-23个长度的RNA均可。要符合设计siRNA的三条原则 ：1即起始密码子75-100个以后，终止密码子100个以前的片断 2 GC比例在35-50之间，最好不要超过55% 3. 最后要进行blast同源分析 。就基本符合条件。 如果选择的AA起始处不一样，序列当然就不一样。不同网站对第一条和第二条的要求不一样，有可能造成给出的序列不一样。但需要提醒的是，对于任一个靶基因（除非已经做过，且有很好的效果），RNAi的选择都带有一定的随机性。

Q2:是否可以插入到真核表达质粒载体中？
A3:可以，这些载体都是真核表达载体，根据国外的经验，质粒载体的knockdown作用一般仅持续一周左右，一周后被down的RNA水平即恢复原有水平，其机制尚未阐明。推荐使用逆转录病毒载体达到稳定转染的效果。

Q3:腺病毒载体转染效果如何？
A3:腺病毒的转染效率主要取决于靶细胞表面的CAR表达水平和感染时所选定的MOI。

Q4:一般设计多少bp的siRNA，以及转录的终止子？
A4:因为人工合成siRNA价格太高，现在经常采用RNAi expression vector，抑制序列一般在19-22bp。使用Pol III启动子时转录终止码为5'-TTTTT-3'，而使用Pol II启动子则为polyA。其实这两种终止码都不能完全避免通读(readthrough)现象的发生。现在RNAi多用前者，是因为其较短，不形成复杂的空间结构；后者因为较长，形成的空间结构可能会对抑制序列发卡结构的形成构成空间阻碍或产生遮挡效应。

Q5:如何使用Pol III启动子制备RNAi表达载体？
A5:目前发表的RNAi表达载体大多采用3型Pol III启动子，如human/mouse U6启动子等。其中人U6启动子有几个明显的特点：1.具有TATA box，位于-30~-25bp，被Pol III转录；2.在转录起点上游-66~47bp处存在PSE(proximal sequence element)，该元件是snRNA激活因子蛋白复合物的结合位点；3.在-244~-214存在DSE(distal sequence element)；4.启动子下游存在5'-TTTT-3'序列为Pol III提供转录终止信号；5.PSE和DSE之间的距离变化可显著影响转录效率；6.+1位的G对转录效率影响较大。根据这些特点，在使用U6启动子构建RNAi表达载体时，U6启动子的长度最好在300bp左右，尽量不改变PSE和DSE的间距，同时保留TATA box和+1位的G，在下游应有5'-TTTTT-3'序列作为终止信号。另外可以根据需要在启动子上游或终止信号下游设计测序引物序列、酶切位点等等。
如有兴趣可以利用同尾酶设计poly-RNAi表达载体，从而可以观察同时knockdown两个或多个基因表达后产生的效应。若是条件允许，可以对U6启动子进行shuffling，筛选具有特殊用途的突变的Pol III启动子。

Q6:下游引物这么长，不知道扩增的时候特异性性好不好？
A6:其实配对的部分有20多个，长度正常。其余是5‘端额外加上的，对特异性没影响。

Q7:为什么RNAi表达载体的克隆有时无法测序？
A7:可能原因是stem的长度刚好和primer相当，所以primer退火时hairpin结构也形成，从而影响测序。分析一下发现它与stem的长度及序列有关。冷泉港推荐改变sense strand上几个碱基，使其在DNA水平不互补，但RNA却能利用G-U互补形成hairpin。

Q8:如何通过PCR获得siRNA表达框？
A8:原理就是先得到U6或H1等启动子的序列片段作为模板，上游引物好说，依照序列copy一段，下游引物设计的要比较长，包括一段与模板匹配的序列，加上gene specific的序列（即你设计的siRNA片段）再加上连续的五个A作为终止子，对于终止子也有人对其进行修饰，使其更有效。

Q9:human u6 promoter 表达框，是如何设计的？
A9:human U6 promoter表达框包括human U6 promoter、终止码TTTTT和中间自行设计的抑制序列或抑制序列的发卡结构。从人基因组中可以扩增出U6 promoter，后面的序列全部自己设计。

Q10:如何获得组织特异性的siRNA？
A10:组织特异性的获得可以采用多种方法：
(1)利用或改造载体的特异性，目前可以查到很多改造腺病毒嗜性的文章，大多通过改造六临体和纤维顶球获得，这种方法被称为靶向转导；
(2)利用组织特异性启动子，被称为靶向转录；
(3)利用组织特异性翻译调控元件，被称为靶向翻译；
(4)利用治疗基因表达产物的作用位点特异性，被称为靶向作用。

Q11:RNA干扰研究通常的程序如何？
A11:通常程序如下：
(1) 选择靶基因；
(2) 选择靶位点：可以通过网络上的免费资源如genesil、Ambion、等等；
(3) 选择基因功能检测方法：必需具备有效的基因功能直接检测方法，才能开展下一步的实验；
(4) 筛选siRNA：因为一段基因中不是每个siRNA都有效，所以常规的做法是制备20个左右的siRNA（体外机器合成dsRNA、体外转录dsRNA、PCR制备含启动子和终止信号的shRNA表达框），导入细胞后检测，选择干扰目标基因最好的siRNA进行下一步实验。但上述步骤工作量繁重。国内的研究者更往往受到研究经费限制，难以按照这个模式开展工作。所以，一些研究者绕过这一步骤。因为有人做了统计，通常4个siRNA中就会有一个有效的siRNA产生（运气不能太差。当然，这个siRNA只是有效的，不一定是很好的）。
(5) 构建shRNA表达质粒：编码shRNA的质粒能够复制，可以不断在体内转录shRNA，因此RNA干扰时间很长。将选择的最有效shRNA序列构建到质粒中；
(6) 将构建的质粒导入细胞，许多细胞因为导入效率低下（10-50%），需要克隆化细胞。检测基因干扰效果或进一步的实验。

Q12:RNA干扰各种方法的优缺点如何？
A12:各种常用方法的优缺点如下：
(1)机器合成dsRNA：优点：快捷，通常3-5天内就可以从供应商处获得40个纯化了的ssRNA，然后退火自己制备dsRNA，一周内就能开始工作。缺点：价格昂贵；RNA质量欠佳和不能做序列测定，所以通常只用作筛选siRNA。
(2)体外转录dsRNA：优点：价格相对低廉，dsRNA质量高，容易导入细胞，基因封闭干扰效果可靠，所以，人们即将它作为筛选siRNA的方法，又直接作为siRNA使用。缺点：操作困难（如自己用试剂盒合成，涉及RNA操作，大多数实验室会感到困难），耗时（如果不仅仅只是作为筛选用，则序列测定方法繁琐且需要很长时间）。
(3)PCR制备编码shRNA的转录DNAs：优点：经济，较快捷，是筛选siRNA的最佳方法。缺点：这种dsDNA导入细胞有一定难度。
(4)shRNA表达质粒：优点：基因干扰效果持久，经济；缺点：制备耗时；导入效率较低下；还涉及质粒在细胞内的定位、shRNA体内折叠效率，非特异性基因抑制等。

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